Crtc1基因敲除肥胖小鼠模型

一、疾病概述 肥胖，与多种高危疾病相关，包括胰岛素抵抗，血脂异常，高血压，心血管疾病和癌症。在肥胖的发展过程中，白色脂肪组织（WAT）中脂肪细胞的体积增大和/或脂肪细胞数量增多，导致WAT感知营养的能力受损，并进一步导致异位脂质沉积。在功能上，皮下白色脂肪组织（sWAT）具有比附睾白色脂肪组织（eWAT）有更大的成脂分化能力。然而，当sWAT无法容纳过多的脂肪沉积时，eWAT中的脂肪积累在一定程度上反映了代谢风险。多种因素与脂肪堆积相关，包括年龄，性别，性激素，遗传学，种族，生活方式等。因此，如何有效的减少脂肪堆积是该领域的主要挑战之一。二、模型背景1、Crtc1基因信息• 敲除基因名称（NCBI号）：382056• 敲除基因NCBI网址链接：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/ 382056• 敲除基因名称（MGI号）：Crtc1（MGI: 2142523）• 敲除基因Ensembl网址链接：http://www.ensembl.org/Mus_musculus/Gene/Summary?g=ENSMUSG00000003575;r=8:70382355-70439579• 方案针对的转录本（Ensembl号）：ENSMUST00000076615.5• 方案敲除的exon：exon2-exon42、实验动物背景信息 所采用的小鼠品系为C57BL/6。 来源：1921年立特(Little)用艾比·拉特洛坡(Abby Lathrop)的小鼠株，雌鼠57号与雄鼠52号交配而得C57BL1937年从C57BL分离出C57BL/6和C57BL/10两个亚系。1985年从Olac引到中国医学科学院实验动物研究所。毛色：黑色。 主要特性：①乳腺肿瘤自然发生率低，化学物质难以诱发乳腺和卵巢肿瘤。②12%有眼睛缺损;雌仔鼠16.8%，雄仔鼠3%为小眼或无眼。用可的松可诱发腭裂，其发生率达20%。③对放射物质耐受力中等;补体活性高;较易诱发免疫耐受性。④对结核杆菌敏感。对鼠痘病毒有一定抵抗力。⑤干扰素产量较高。⑥嗜酒精性高，肾上腺素类脂质浓度低。对百日咳组织胺易感因子敏感。⑦常被认作"标准"的近交系，为许多突变基因提供遗传背景。 主要用途：是肿瘤学、生理学、免疫学、遗传学研究中常用的品系。3、研究背景 Crtc1, CREB调控转录共激活因子1，系CREB转录辅因子家族的成员之一，在存在cAMP刺激的情况下，可作为调节CREB活性的传感器[1, 2]。前期研究发现，Crtc1缺失对小鼠生殖能力有显著影响，还参与了昼夜节律的调节[3]，外周葡萄糖代谢[4]，心脏功能[5]，记忆形成[6]，抑郁症[7]等生理、病理进程。肥胖，与多种高危疾病相关，包括胰岛素抵抗，血脂异常，高血压，心血管疾病和癌症。许多病因包括年龄，性别，性激素，遗传学，种族，生活方式等，都有助于脂肪积累[8, 9]。如何有效的减少脂肪堆积仍是该领域的主要挑战。有趣的是，我们发现Crtc1-/-小鼠会发生自发的肥胖，且目前并无相关研究探究Crtc1在脂肪组织中的作用，因此，我们首先探究Crtc1对脂肪组织代谢的影响和潜在分子机制的研究。另有相关研究表明，Crtc1与呼吸系统相关疾病也有关系。有研究[10]发现LKB1通过促进CRTC1从细胞核的胞质易位而负调控NEDD9转录，部分逆转了LKB1对肺癌细胞转移的抑制作用。该研究结果为解释LKB1缺乏促进肺癌进展和转移提供了潜在的分子机制与治疗靶点。另有研究发现[11-13]，在肺粘液表皮样癌（MEC）在很多情况下，伴随着新型融合癌基因（CRTC1-MAML2）的复发性t（11; 19）易位，CRTC1-MAML2癌基因充当Notch和CREB调节途径的转录因子，破坏正常的细胞周期和分化，从而促进肿瘤的发展。CRTC1-MAML2不仅可以作为判断肿瘤是否发生的标志物，也显著影响肿瘤患者的预后状况和抗肿瘤药物的治疗效果。有研究通过microRNA 组学分析，卵白蛋白（OVA）诱导的过敏性气道炎症（AAI）小鼠的肺组织中miRNA的改变，鉴定出miR-17，miR-144和miR-21可能发挥重要作用，通过计算机预测分析出转录因子cAMP反应元件结合蛋白（Creb1）及其转录共激活因子（Crtc1-3）可能作为其潜在靶点，有望成为治疗哮喘疾病的靶点[14]。参考文献：1. Altarejos, J.Y., et al., The Creb1 coactivator Crtc1 is required for energy balance and fertility. Nat Med, 2008. 14(10): p. 1112-7.2. Iourgenko, V., et al., Identification of a family of cAMP response element-binding protein coactivators by genome-scale functional analysis in mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A, 2003. 100(21): p. 12147-52.3. Jagannath, A., et al., The CRTC1-SIK1 pathway regulates entrainment of the circadian clock. Cell, 2013. 154(5): p. 1100-1111.4. Kim, G.H., et al., Leptin recruits Creb-regulated transcriptional coactivator 1 to improve hyperglycemia in insulin-deficient diabetes. Mol Metab, 2015. 4(3): p. 227-36.5. Morhenn, K., et al., Mechanistic role of the CREB-regulated transcription coactivator 1 in cardiac hypertrophy. J Mol Cell Cardiol, 2019. 127: p. 31-43.6. Uchida, S., et al., CRTC1 Nuclear Translocation Following Learning Modulates Memory Strength via Exchange of Chromatin Remodeling Complexes on the Fgf1 Gene. Cell Rep, 2017. 18(2): p. 352-366.7. Wang, Y.J., et al., Imipramine exerts antidepressant-like effects in chronic stress models of depression by promoting CRTC1 expression in the mPFC. Brain Res Bull, 2020. 164: p. 257-268.8. Emerging Risk Factors, C., et al., Separate and combined associations of body-mass index and abdominal adiposity with cardiovascular disease: collaborative analysis of 58 prospective studies. Lancet, 2011. 377(9771): p. 1085-95.9. Malden, S., et al., Obesity in young children and its relationship with diagnosis of asthma, vitamin D deficiency, iron deficiency, specific allergies and flat-footedness: A systematic review and meta-analysis. Obes Rev, 2020.10. Feng, Y., et al., The CRTC1-NEDD9 signaling axis mediates lung cancer progression caused by LKB1 loss. Cancer Res, 2012. 72(24): p. 6502-11.11. Von Holstein, S.L., et al., CRTC1-MAML2 gene fusion in mucoepidermoid carcinoma of the lacrimal gland. Oncol Rep, 2012. 27(5): p. 1413-6.12. O'Neill, I.D., Gefitinib as targeted therapy for mucoepidermoid carcinoma of the lung: possible significance of CRTC1-MAML2 oncogene. Lung Cancer, 2009. 64(1): p. 129-30.13. O'Neill, I.D., t(11;19) translocation and CRTC1-MAML2 fusion oncogene in mucoepidermoid carcinoma. Oral Oncol, 2009. 45(1): p. 2-9.14. Bartel, S., et al., Pulmonary microRNA profiles identify involvement of Creb1 and Sec14l3 in bronchial epithelial changes in allergic asthma. Sci Rep, 2017. 7: p. 46026.

1.项目策略图

此模型采用CRISPR/Cas9技术对Crtc1基因进行基因编辑，原理示意图如下：

2.项目策略概述

利用CRISPR/Cas9技术，设计并体外转录gRNA, 将Cas9、gRNA同时注射到小鼠的受精卵中。Cas9蛋白在gRNA引导下结合到靶位点进而造成DNA双链断裂，从而实现靶位点碱基序列缺失，实现基因敲除。

3.gRNA序列信息

gRNA1:GCTGACATCTGTGAATTGTA (5’ – 3’), PAM: GGG.

gRNA2:CTGCATGCTGGATCGACAGG (5’ – 3’), PAM: TGG.

4. 正常喂养条件下，检测8个月大的Crtc1+/+和Crtc1-/-小鼠的体重，心脏，肝脏，体重，eWAT，sWAT，和BAT的重量。

5. 正常喂养条件下，检测8个月大时Crtc1+/+和Crtc1-/-小鼠的甘油三酸酯，总胆固醇，FABP4含量。通过油红O或H＆E染色，检测肝和eWAT的脂肪细胞面积，并进行量化。

图1. 构建Crtc1敲除鼠。（A）使用CRISPR/Cas9系统敲除Crtc1基因示意图。（B）通过PCR鉴定Crtc1敲除鼠。（C）Western blotting检测Crtc1的蛋白质水平。2.2 Crtc1敲除小鼠不育 我们发现Crtc1的全身缺乏会导致生育能力严重受损。在Crtc1-/-雄性和Crtc1-/-雌性小鼠的三个交配笼子中，只有一只小鼠出生，并立即死亡。但是，杂合的Crtc1 +/-小鼠具有正常的生育能力，并以预期的孟德尔频率出生（表1）。表1杂合Crtc1+/-小鼠交配后代小鼠信息

2.3 Crtc1敲除小鼠会造成自发肥胖 在正常喂养条件下，与8个月大的Crtc1 + / +小鼠相比，Crtc1-/-小鼠显示出明显更大的体型和较重的体重（图2A）。显然，体重增加的原因主要包括eWAT，sWAT和BAT脂肪重量增加（图2E-G）。这些数据表明在发育过程中Crtc1-/-小鼠自发地发展为肥胖。

图2. Crtc1-/-小鼠自发地发展为肥胖结果。（A）Crtc1+/+和Crtc1-/-小鼠的代表性图像和体重；（B）Crtc1+/+和Crtc1-/-小鼠进食量的观察；（C）Crtc1+/+和Crtc1-/-小鼠进食量的柱状图展示；（D）Crtc1缺失对不同器官重量的影响，包括肝脏, eWAT，sWAT和BAT。数据为平均值±SEM。* P <0.05；** P <0.01，*** P <0.001，n.s. 表示无统计学差异。

CRTC1缺失加速脂肪细胞中脂肪的积累

尽管两组之间的血浆TC和TG没有统计学差异，但是Crtc1-/-小鼠血浆FABP4的水平较高，FABP4是主要由脂肪细胞分泌的脂肪因子（图3A-C）。 此外，与Crtc1 + / +小鼠相比，Crtc1-/-小鼠的空腹血糖（FBG）水平显着升高（图3D）。 肝脏和脂肪是控制脂质代谢的主要组织。 H＆E和油红O染色显示Crtc1缺乏对肝脏形态和脂质滴的形成没有显著影响（图3E）。 但是，我们发现与Crtc1 + / +小鼠相比，来自Crtc1-/- eWAT的脂肪细胞平均面积显着增加（图3G）。 这些数据表明，Crtc1缺失后脂肪积累的增加可能归因于脂肪细胞的分化和成熟。

图3. Crtc1-/-小鼠脂质代谢异常相关结果。（A-C）8个月大时Crtc1+/+和Crtc1-/-小鼠的甘油三酸酯（A），总胆固醇（B），FABP4含量（C）的循环水平。（D）来自Crtc1+/+和Crtc1-/-小鼠的肝组织的油红O或H＆E染色。（E）肝脏油红色阳性区域的定量。（F）来自Crtc1+/+和Crtc1-/-小鼠的eWAT的H＆E染色。（G）eWAT中脂肪细胞面积的量化。数据为平均值±SEM。* P <0.05；*** P <0.001和n.s. 表示无统计学差异。TG，甘油三酸酯。TCh，总胆固醇。

dsDNA升高，皮肤破损，皮肤炎性细胞浸润。

血清学检测抗dsDNA和抗ANA抗体，表型观察皮肤破损情况，病理观察淋巴细胞浸润情况。

模型动物饲养在武汉大学人民医院动物房SPF级动物实验室，实验动物使用许可证SYXK（鄂）2015-0027。

（1）建筑特点

门采用专用净化密闭门并配备观察窗。单向走道呈顺时针走向设计。屏障系统内共有大鼠饲养室1间，小鼠饲养室3间，隔离观察室1间，实验准备室1间，洁物存放室1间，清洗消毒室1间。此外，屏障系统外配有监控室、机房和配电室等。

（2）设计参数

室内温度：20～26°C；日温差：≤4°C；相对湿度：40%～70%；换气次数：15～20次/h；气流速度：≤0．2m/s；压强梯度：20～50Pa；空气洁净度：7级；菌落数：≤3个/皿；氨浓度：≤14mg/m3；噪声：≤60dB；Z低工作照度：≥200lx；动物照度：15～20lx；昼夜明暗交替时间：12/12h。

（3）通风和空调系统

动物实验室采用全新风中央空调通风系统。空气经过初、中、三级过滤器后进入实验室内环境。

（4）照明系统

一更、淋浴、二更、气闸、清洁走道、洁物存放处、污物走道、缓冲间和清洗消毒间、动物饲养室、实验准备间、隔离观察室和功能实验室等安装有手动和自动开关，根据实际需要，调节控制室内照明灯。未启用房间、清洁走道、洁物存放处、污物走道等在每日中午12点和晚上8点开启紫外线灯照射1h。

（5）通讯系统

因为SPF级动物实验室的环境和设施具有特殊要求，人员进入后不能随意出入，而室内外的联系又十分重要，故室内各房间均安装内部电话机，按照房间顺序编排电话号码，各室内电话可相互连通，并均与监控室总机保持联系，保证实验室内外信息的及时沟通。

（6）监控系统

对SPF级动物实验室的出入口、走道、实验动物饲养室、功能操作室等重要位置均安装了可作270°旋转的摄像机，能够及时了解设施的运行状态；也能有效督促实验人员执行科学的操作规程，避免人为因素造成室内环境和设施的污染；并对整个实验期间的动物状态和反应进行观察，减少对动物的滋扰。

（7）供水系统

SPF级实验动物饮用水以纯净水为宜。本实验室采用管道供水，将处理后的纯净水用塑胶管道输送到屏障系统内实验准备室，设置接水槽，为实验动物供应灭菌的饮用水和屏障系统内用水。要经常更换和清洗输水管道，清洗笼具的用水添加适当比例的84消毒液。

（8）供电系统、警报系统和消防设施

SPF级动物实验室要求全天候不间断供风和供电，如果出现故障，不能及时发现和处理，就可能导致环境设施的污染、动物感染或死亡，造成严重后果。因此应对SPF级动物实验室使用独立稳定的供电系统，并配备有应急电源。在中央空调机房控制室安装风机故障警报系统，以便及时检修和维护，保证设施的安全运行。

（9）消毒灭菌设备

为防止外界物品进入SPF级动物实验室时所携带的细菌污染室内环境和造成动物交叉感染，按照不同物品的特性，进行紫外线照射消毒、渡槽消毒液消毒或专用的机动门真空灭菌器消毒。

（10）动物饲养笼具

饲养大、小鼠的笼具聚碳酸脂材料的塑胶笼具，具有高透明、耐高压、耐高温、耐酸碱等特点。通用的不锈钢笼具长、宽、高分别为40、30、20cm，适用于单笼饲养有特殊要求的实验动物，配有底盘和食槽，确保实验动物有充足的采食和活动空间，同时也保证室内环境的清洁。

（11）垫料的选择和使用

在使用塑胶垫料时，垫料是大小鼠直接接触的铺垫物，起到吸湿、保暖和造窝的作用。垫料的好坏直接影响到大小鼠术后的恢复、生长发育和繁殖性能。目前，所使用的垫料主要有玉米秸垫料、刨花垫料。

（12）饲料配制

大小鼠的生产型饲料和维持型饲料必须严格按照国家标准，进行科学配制生产。每半年检测一次饲料的微生物指标和有效营养成分指标，保证饲料的质量。

Crtc1，一种调节CREB活性的转录辅助因子，已参与代谢综合征的发病机理。但是，Crtc1对脂肪组织代谢的影响及其潜在机制尚不清楚。我们首先发现Crtc1-/-小鼠的体重和脂肪重量（包括sWAT，eWAT和BAT）显著增加，血浆进行了生化分析，发现与Crtc1 + / +小鼠相比，Crtc1-/-小鼠出现了高血糖症。

我们发现缺乏Crtc1严重损害了小鼠的生殖能力。Crtc1缺失对肝脏的脂代谢无显著影响。然而，通过H＆E染色证实，Crtc1-/-小鼠的脂肪细胞的面积有显著增加的趋势。总之，我们的研究发现，Crtc1-/-缺乏引起脂肪堆积可能与PPARγ信号通路的激活有关；表明CRTC1可能成为治疗肥胖的一个潜在分子靶点。